ข้อกำหนดการทดสอบชุด ELISA

สร้างความแตกต่างที่ดีในการทดสอบอย่างเป็นทางการ ควรใช้เงื่อนไขการทดสอบของการควบคุมเชิงบวกและเชิงลบ และตัวอย่างที่จะทดสอบควรทำเป็นสองชุดเพื่อให้มั่นใจถึงความถูกต้องของผลการทดสอบ

บางครั้งพื้นหลังอาจสูงกว่า ซึ่งบ่งบอกถึงปฏิกิริยาที่ไม่เฉพาะเจาะจง สามารถปิดได้ด้วยเซรั่มแกะ เซรั่มกระต่าย หรือ BSA

การเลือกเงื่อนไขการทดลอง

ใน ELISA สิ่งสำคัญคือต้องเลือกเงื่อนไขการทดลองต่างๆ ซึ่งรวมถึง: (1) การเลือกตัวพาเฟสของแข็ง-: สารหลายชนิดสามารถใช้เป็นตัวพาเฟสของแข็ง- ได้ เช่น PVC, โพลีสไตรีน, โพลีอะคริลาไมด์ และเซลลูโลส อาจอยู่ในรูปแผ่นเว้า หลอดทดลอง ลูกปัด ฯลฯ ปัจจุบันนิยมใช้แผ่นเว้าโพลีสไตรีนขนาด 40 หลุม

ไม่ว่าผู้ให้บริการชนิดใด สามารถคัดกรองก่อนการใช้งานได้: ด้วยแพ็คเกจแอนติเจนในปริมาณเท่ากันภายใต้เงื่อนไขการทดลองเดียวกันที่จะทำปฏิกิริยา เพื่อสังเกตว่าปฏิกิริยาการแสดงสีนั้นเป็นเนื้อเดียวกันหรือไม่ ตามประสิทธิภาพการดูดซับที่ดี (2) การบรรจุหีบห่อโดยการเลือกแอนติบอดี (หรือแอนติเจน): แอนติบอดี (หรือแอนติเจน) ที่ถูกดูดซับบนพื้นผิวของตัวพาเฟสของแข็ง- ความรุนแรงของข้อกำหนดจะดีกว่า โดยทั่วไปการดูดซับต้องใช้ค่า pH อยู่ระหว่าง 9.0 ถึง 9.6 อุณหภูมิ เวลา และปริมาณโปรตีนในการดูดซับก็มีผลกระทบเช่นกัน โดยทั่วไปจะมากกว่า 4 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 18 ถึง 24 ชั่วโมง ความเข้มข้นที่เหมาะสมของแพ็คโปรตีนจำเป็นต้องได้รับการไทเทรต: หลังจากบรรจุด้วยความเข้มข้นของโปรตีนที่แตกต่างกัน (0.1, 1.0 และ 10 µg/ml เป็นต้น) ค่า OD ของตัวอย่างที่เป็นบวกจะถูกสังเกตเมื่อมีเงื่อนไขการทดสอบอื่นๆ เหมือนกัน เลือกความเข้มข้นที่มีค่า OD มากที่สุดและปริมาณโปรตีนต่ำสุด

สำหรับโปรตีนส่วนใหญ่ โดยปกติจะอยู่ที่ 1 ถึง 10 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร (3) การเลือกความเข้มข้นในการทำงานของเอนไซม์-ของแอนติบอดีที่มีป้ายกำกับ: ขั้นแรก ผลเริ่มต้นของการไทเทรตโดยใช้วิธี ELISA โดยตรง (ดูเอ็นไซม์-ส่วนของแอนติบอดีที่มีป้ายกำกับ)

จากนั้นแก้ไขเงื่อนไขอื่นๆ หรือใช้ "วิธีอาร์เรย์สี่เหลี่ยม" (แพ็คแบบหงุดหงิด การอ้างอิงสำหรับตัวอย่างที่จะตรวจสอบ และเอนไซม์-แอนติบอดีที่ติดฉลากไว้เป็นการเจือจางที่แตกต่างกัน) ในระบบการทดลองอย่างเป็นทางการจะไตเตรทความเข้มข้นในการทำงานอย่างแม่นยำ (4) การเลือกฐานของเอนไซม์และผู้ให้ไฮโดรเจน: การเลือกใช้ผู้บริจาคไฮโดรเจนมีราคาไม่แพง ปลอดภัย มีปฏิกิริยาการเรนเดอร์สีที่ชัดเจน- และตัวมันเองไม่มีสี ผู้บริจาคไฮโดรเจนบางราย (เช่น OPD เป็นต้น) อาจมีผลกระทบต่อการก่อมะเร็ง ควรใช้ความระมัดระวังในการป้องกัน บุคคลที่มีเงื่อนไขควรใช้-สารก่อมะเร็งและมีความไวสูงจากผู้บริจาคไฮโดรเจน เช่น TMB และ ABTS ซึ่งปัจจุบันเป็นผู้บริจาคไฮโดรเจนที่น่าพึงพอใจมากกว่า หลังจากผ่านไประยะหนึ่ง ควรเติมกรดหรือด่างแก่เพื่อหยุดปฏิกิริยา โดยปกติแล้วเวลาในการดำเนินการของวัสดุพิมพ์คือ 10-30 นาทีจึงจะเหมาะสม ต้องเตรียมน้ำยาสำหรับใช้ซับสเตรตใหม่ โดยเฉพาะอย่างยิ่งหากเติม H2O2 ก่อนใช้งาน